合成生物学在蛋白质功能材料领域的研究进展

蛋白质功能材料及合成特点：

◆ 良好的生物相容性；

◆ 优良的生物可降解性；

◆ 低毒性、抗菌性等多功能特性；

◆ 具有极大发展潜力的天然大分子材料；

◆ 提取方法受制于伦理和法律不能用人体组织提取 

◆ 无法高密度饲养 

◆ 排斥反应大、产品批次质量不均一、生物功效不稳定等

◆ 天然功能蛋白 DNA 序列在微生物体系中不稳定或者表达量低 

蛋白质功能材料，包括蛛丝蛋白、蚕丝蛋白、贻贝蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白等，由于其独特的材料特性，近年来受到国内外研究者的广泛关注，也开展了大量研究。

胶原蛋白：以其良好的凝胶性、吸水性、生物相容性、可降解、无毒等诸多优良特性，在伤口缝线、软骨缺损填充、骨骼金属植入物镀膜等领域广泛应用，是一种非常重要的生物医用材料。

王盼团队以微生物为底盘，在胶原蛋白的高效合成领域取得了重要突破，在国际上首次实现了类人胶原蛋白的量产。

蚕丝蛋白：蚕丝应用广泛且具有优异的穿戴舒适性，南开大学刘遵峰团队利用天然纯蚕丝制备了一种新型的“人工肌肉”纤维，能够感知皮肤表面湿度而自动调节衣袖长短，可用于智能织物和柔软机器人研发等领域。

塔夫茨大学 David L. Kaplan 教授团队使用软刻蚀技术加工蚕丝蛋白制作细胞培养支架、成骨细胞培养、骨骼修复螺钉、伤口愈合贴片等。

贻贝蛋白：海洋贻贝黏附蛋白具有高强度、高韧性、防水性以及极强的黏附基体等功能，兼具优异的生物相容性和可降解性，是实现细胞和组织之间的高效黏合的理想材料，并且可以在皮肤组织、黏膜组织、软骨、骨骼等创口和手术切口的黏合中发挥作用。

天津大学张雷和齐海山团队采用生物合成的方法成功制备出“贻贝仿生多功能蛋白材料”能够简便快速黏附在医用材料表面，同时具备抗污、抗菌、防雾和良好生物相容性等多种功能，可成为应用于医疗设备和体内植入器件的“超级涂层”。

蛛丝蛋白：天然的蛛丝蛋白是一种极其柔软的蛋白，同时具有强度高、弹性好等极佳性能。基于体外重组蛛丝蛋白构成的新型生物材料，如纳米纤维、水凝胶、多孔海绵及微胶囊等，可应用于药物可控释放、组织工程支架等材料。

蛋白质的功能活性与其结构密切相关，我们已经获取了海量的生物序列数据，深入有效的信息挖掘和分析才能提炼出物质结构与功能的关系，实现蛋白生物合成的定向性和高效性。

2.1蛋白质功能材料的结构特性：

材料蛋白的重复单位

▲表源《合成生物学在蛋白质功能材料领域的研究进展》

具有独特材料特性的蛋白质都具有特定氨基酸含量高、片段高度重复等特性。例如蛛丝蛋白主要由重复的 poly-Ala、Gly-Gly-X 和 Gly-Pro-Gly-Gln-Gln 组成，重复序列决定了蛛丝蛋白的纤维性能。基因核心序列的高度重复导致全长基因获取难度加大，高重复序列的结构也为后续的蛋白表达带来非常大的挑战。

Prince 等设计合成了来源于 Nephila clavipes蜘蛛的主壶腹腺丝蛋白1中典型的富含丙氨酸的SPI序列，以及主壶腹腺丝蛋白 2中的SPII序列，这些序列在大肠杆菌中加倍或组合表达，产生的一系列不同分子量聚合物均含有 β-折叠结构。

2.2蛋白质功能材料的设计与改造：蛋白质功能材料也能受到环境温度、pH、黏附、增殖、降解等因素调控。功能特性也可以在分子水平上通过设计功能肽与目标蛋白的融合来实现。

自组装多肽RADA-16 （RADARADARADARADA）能够迅速自组装成网状纳米纤维屏障，起到快速止血的效果，李宏民等将多肽RADA-16与类弹性蛋白序列融合并在大肠杆菌中诱导表达，最终获得的融合蛋白具有良好的止血效果。

来源于化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的一类高产 Scl2 胶原蛋白也得到了广泛的关注。金玲玲将不同数量的 RGD 序列和整联蛋白结合序列（GFPGER）引入 Scl2 胶原蛋白骨架上，改造后的 Scl2 的蛋白能够促进小鼠成纤维细胞的贴壁生长。

随着基因编辑技术和合成生物学的快速发展，对蛋白质功能材料的合成途径与底盘细胞之间的适配性进行优化，完善基因表达、蛋白质分泌和胞外自组装过程，将会改善材料表达率低、适配性差、结构及功效不稳定等问题，从而大幅提高蛋白质功能材料的合成效率。

3.1 目的蛋白的表达与修饰：构建高效的生物元件库，确保基因在转录和翻译过程中的稳定和高效。

Bowen 等通过优化5′ UTR、RBS、终止子等表达元件，并设计断裂蛋白质内含子（SI）序列构建了 SI-Bricks 系统 ，可以触发蛋白质之间融合形成更大的蛋白质，最终成功表达出 556 kDa 的丝蛋白链，分子质量几乎是天然丝蛋白的两倍。

3.2 发酵过程的调控与分离纯化：

Xue等采用二氧化碳脉冲法首次研究了重组E.coli不同生长阶段二氧化碳浓度对重组蛋白生产的影响。针对高密度发酵时乙酸持续积累引起目标蛋白表达受阻，利用脉冲补料方式控制细胞处于一定的饥饿阶段，使细胞在葡萄糖存在的情况下利用乙酸作为碳源，减小乙酸对细胞的毒性。

用修饰的肠沙门氏菌的 III 型分泌系统表达这些特殊的蛋白质，上调肠链球菌中 III 型分泌相关基因提高几种重组生物聚合物形成蛋白的分泌和纯度，全长形式蛋白（包括节肢弹性蛋白、弹性蛋白和丝蛋白等）均一性显著增强。改造之后的细胞分泌系统，不分泌截短的蛋白质，因此在培养物收获过程中没有发现，这也为全长形式的生物大分子的纯化提供了极大便利。

3.3 细胞工厂的重构与优化：在基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学研究的基础上，构建基因组规

模代谢模型（genome-scale metabolic model，

GSMM），可以全局化、系统性地掌握底盘细胞的代谢及生理特性，预测底盘细胞在特定环境中的表型，从而合理设计代谢途径。

南京农业大学 Pan 等通过融合PCR将 Cre/lox 系统、筛选标记 Zeocin 以及同源臂成功拼接，建立了酵母基因组快速编辑方法，并且无需引入选择标记。

蛋白质功能材料的后加工是实现其在生物医学等领域实际应用的关键步骤。光刻、3D 打印等微纳制造技术应用在了蛋白质功能材料的后加工中。

4.1 贻贝蛋白的加工及应用：重组贻贝蛋白能够通过旋涂、浸涂等方法在医用材料表面形成涂层，改善细胞的黏附、增殖和分化等行为，还能作为介质材料将生物分子如细胞微环境因子、核酸、治疗药物、无机纳米粒子等固定在靶表面上。

4.2 弹性蛋白的加工及应用：研究者们利用重组蛋白技术制备了具有温度响应特性的弹性蛋白样多肽（ELP）。

ELP在临界温度（Tt）以下，高分子链以无序、随机的水合形式存在；当温度升高至 Tt以上时，聚（GVGVP）序列产生疏水性折叠，形成β-螺旋结构从而引起相分离 。使得 ELP能够在水溶液中发生自组装，形成水凝胶或者纳米凝胶，实现药物递送。

4.3 胶原蛋白的加工及应用：

王盼团队将重组胶原蛋白与壳聚糖、透明质酸通过分子间自组装形成新型可注射pH/温度敏感型的水凝胶，用于皮下填充及疤痕修复，能够快速促进疤痕修复，将重组胶原蛋白与不同分子量的普鲁兰多糖交联，获得抗降解能力的水凝胶，用于皮肤组织、软骨修复，使水凝胶的降解速度与组织的生成速度相匹配。

合成生物学具有可利用再生资源、低污染、易控制、可对生物大分子进行定向设计的优点，伴随着蛋白质功能材料的功能原理及新颖设计理念被逐步挖掘和解析，已经发展出在特定条件下性能优异的替代材料，已有报道证实了这类蛋白质功能材料在癌症诊断与治疗、再生医学、基因传递系统、数据存储等领域具有巨大的应用价值。